Biologia dei sistemihttp://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/8212024-03-28T23:56:48Z2024-03-28T23:56:48ZRole of Annexin A1 in tumor progressionBelvedere, Raffaellahttp://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/24922019-05-30T12:08:40Z2016-10-06T00:00:00ZRole of Annexin A1 in tumor progression
Belvedere, Raffaella
Annexin 1 (ANXA1) is a multifunctional protein of 37 kDa, and represents the first characterized member of the annexin superfamily, so called since their main property is to bind (i.e. to annex) cell membranes in Ca2+-dependent manner. ANXA1 is over-expressed in tissues from patients affected by pancreatic carcinoma (PC), where the protein seems to be associated with the malignant transformation and the poor prognosis. In this PhD project, experiments were performed to understand the role of ANXA1 in human PC development with particular attention to migration and invasion processes. We observed in all the analyzed PC cell lines, a huge expression and a localization of ANXA1 mostly on the motility sub-structures. Interestingly, in MIA PaCa-2 cells we found also two cleaved forms of ANXA1 (33 and 3 kDa) that localize at cellular membranes and are secreted outside the cells, as confirmed by MS analysis. MIA PaCa-2 and PANC-1 cell lines express Formyl Peptide Receptors (FPRs) 1 and 2: the treatment of this cells with the ANXA1 mimetic peptide, Ac2-26, induced intracellular calcium release, consistent with nFPR activation, and significantly increased cell migration/invasion rate. ANXA1 effects on MIA PaCa-2 and PANC-1 migration and invasiveness were observed both by down-modulating its expression through siRNAs and by treatment with a blocking antibody. The importance of the secreted form of ANXA1 in cellular motility was confirmed when MIA PaCa-2 were compared with PANC-1 cells that lack both the cleaved and the externalized forms. Moreover, the treatment of PANC-1 cells with MIA PaCa-2 supernatants, significantly increased the migration rate of these cells. To better characterize the functional role of the protein in PC progression, ANXA1 Knock-Out (KO) clones from MIA PaCa-2 cells were obtained. The expression of several proteins was affected by the absence of ANXA1, particularly the cytoskeletal organization was negatively conditioned. In fact, MIA PaCa-2 ANXA1 KO lost their migratory and invasive capabilities, proliferated more rapidly and seemed to acquire a less aggressive phenotype. To confirm this aspect the MIA PaCa-2 wild type, PGS (the scrambled vector) and ANXA1 KO were implanted to create orthotopic xenograft in vivo. The PC mass of ANXA1 KO MIA PaCa-2 was not significantly smaller than the other experimental points, but the metastatization degree appeared particularly reduced as showed on livers of mice with MIA PaCa-2 wild type and PGS which showed a higher degree of metastatic lesions compared to MIA PaCa-2 ANXA1 KO.
This project provides new insights on the role of ANXA1 in PC progression. In in vitro models, the intracellular ANXA1 is involved in the maintenance of the cytoskeleton integrity. When secreted, the protein stimulates PC cells migration and invasion through FPR activation. This is confirmed by in vivo xenograft experiments where ANXA1 appears to stimulate the metastatization process. [edited by author]
2014 - 2015
2016-10-06T00:00:00ZStudio dei meccanismi molecolari alla base dell’azione dei microRNA in processi patologiciBruno, Giuseppinahttp://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/24902019-05-30T12:01:35Z2016-05-10T00:00:00ZStudio dei meccanismi molecolari alla base dell’azione dei microRNA in processi patologici
Bruno, Giuseppina
My research project concerns the study of the molecular mechanisms involving microRNAs (miRNAs) in pathological processes such as tumors and cardiovascular diseases. miRNAs are small non-coding RNAs (sncRNAs) acting by modulating post-transcriptionally gene expression of specific mRNA target. Many studies have shown that the aberrant expression of these sncRNA is closely correlated with the onset of many diseases, including cancer and occlusive cardiovascular syndromes. Therefore, the study was conducted on three different experimental models such as activated platelets in vitro, tumor tissues of endometrial cancer (EC) and breast cancer (BC) cells expressing the estrogen receptor β (ERβ). Platelet activation is involved not only in physiological processes as haemostasis but also in the thrombogenesis and the pathogenesis of occlusive cardiovascular disorders including Acute Coronary Syndromes (ACS). However, the several events of resistance to antithrombotic therapies suggest the existence of mechanisms, at the basis of the activation process, still not known. The data that I obtained, following ex vivo activation of platelets from healthy donors, demonstrated the existence of miRNA pathway maturation in platelets and a significant reorganization of platelet proteome mediated by miRNAs upon activation. EC is one of the most frequent types of cancer affecting the female population and devopls, in most of cases, from an hyperplastic condition. I identified changes in the expression of miRNAs and other sncRNAs from paired normal, hyperplastic and cancerous endometrial tissues obtained by hysteroscopy. The results obtained allowed me to define a signature of sncRNAs deregulated in neoplastic transformation, characterized by 129 miRNAs, 10 piRNAs (PIWI-interacting RNAs) and 3 snoRNAs (small nucleolar RNAs). Moreover, in silico analysis of downstream targets revealed that these endometrial sncRNAs are involved in several cellular processes and canonical pathways, including TGF-β, ERK/MAPK and Wnt/β-catenin signaling pathways. In 70% of the cases BC is a hormone-responsive tumor since cells are able to respond to proliferative stimuli induced by estrogens thanks to estrogen receptors (ERs). Recent studies have shown that unliganded-ERβ is equally distributed between the nucleus and cytoplasm and that its presence determines a reduction of cell growth. In this study, by applying gene expression profiling and in vivo global mapping of ERβ binding site to genome, I have demonstrated that the receptor is able to regulate gene expression at transcriptional level also in the absence of ligand. The results obtained from smallRNA-seq experiments revealed that miRNAs expression profile is influenced by costitutive-ERβ activity in MCF-7 BC cells. Proteomic analysis of molecular partners of unliganded ERβ showed an association with Argonaute 2 (AGO2). RNA immunoprecipitation coupled to massive parallel sequencing (RIP-Seq) experiments revealed that ERβ-AGO2/miRNA complex is able to bind and regulate at post-transcriptional level specific mRNAs involved in several biological pathways in BC cells deprived of hormonal stimuli. [edited by author]
2014 - 2015
2016-05-10T00:00:00ZStudio del meccanismo d’azione e dei parametri strutturali di nuovi materiali ad azione antimicrobicaMatrella, Simonahttp://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/24802019-05-30T11:43:33Z2017-03-28T00:00:00ZStudio del meccanismo d’azione e dei parametri strutturali di nuovi materiali ad azione antimicrobica
Matrella, Simona
The increased demand of new and more effective materials able to reduce and prevent microbiological contamination is one of the great challenges of scientific research. In the last decade, the use of antimicrobial polymers has aroused a huge interest in the scientific community because they are effective, safe and able to avoid spreading multidrug-resistant microorganisms. Recently, Dr. Lorella Izzo of the University of Salerno developed a new family of non-leaching antimicrobial copolymers having star-type architecture A(BC)n (n = 1, 2, 4) containing m-PEG (block A), methylmethacrylate (MMA), and nonquaternized 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate (DMAEMA) (blocks BC). Preliminary studies conducted on this copolymer have shown that their antimicrobial properties depends on the DMAEMA monomers and are strongly related to the topological structure of the composing copolymers. The first goal of my PhD project was to assess whether the antimicrobial and hemolytic activity of PEG(MMA-DMAEMA)n was influenced by the change of the three main components of copolymers: balance between charge density (AAEMA) and hydrophobicity (MMA), polymer architecture and variation of the N-substituent groups. To this aim, two new series of insoluble copolymers surfaces PEG(MMA-AAEMA)n-like were synthesized. They consisted inA(BC), A(BC)2 and A(BC)4 architectures, different ratio between AAEMA/MMA and different N-alkyl substituents of alkyl-aminoethyl methacrylates (AAEMAs: methyl, Me; ethyl, Et; isopropyl, i-Pr; and tert-butyl, t-Bu). We found that the antimicrobial activity of films was dependent on the amount of surface charge density rather than the hydrophobicity and they did not induce any hemolytic activity. The second objective of this project was to investigate the mechanism of action of these antimicrobial surfaces on gram-negative bacteria Escherichia coli. It has been shown that the copolymers cause an alteration of bacteria’s outer membrane permeability after 30 minutes of treatment, instead the cells died after treatments longer than 60 minutes. However, the bactericidal action of copolymers did not depend by the interaction with intracellular receptor because they directly interact with the cell membranes. Considering that the cationic pedant groups of AAEMA are not long enough to completely penetrate the cell wall, it has been suggested that the copolymers after the electrostatic interaction with bacteria surfaces interact with the LPS molecules causing the loss of stability of the outer membrane and the dead of bacteria. These findings provided enough evidence to speculate the mechanism of action of new antimicrobial surfaces PEG(MMA-AAEMA)n. [edited by author]; Lo sviluppo di materiali che inibiscono e prevengono la contaminazione microbiologica rappresenta una delle grandi sfide della ricerca scientifica. Negli ultimi anni l’impiego dei polimeri antimicrobici ha suscitato un enorme interesse perché efficace, sicuro e soprattutto in grado di evitare la formazione e la diffusione di microrganismi multiresistenti. Recentemente, presso il laboratorio della Dott.ssa Lorella Izzo, del Dipartimento di Chimica e Biologia dell’Università di Salerno, è stata sintetizzata una nuova famiglia di superfici antimicrobiche costituite da copolimeri insolubili in acqua aventi architettura a stella del tipo A(BC)n con n = 1, 2, 4 in cui A rappresenta un blocco a base di mPEG (monometossi poli(etileneglicole)), e BC una catena polimerica random costituita da MMA (metilmetacrilato) e DMAEMA (2-(dimetilammino)etilmetacrilato). L’ attività antimicrobica di tali film è legata alla presenza dei monomeri di DMAEMA in quanto, essendo in grado di autoquaternizzarsi in acqua, conferiscono una carica positiva ai copolimeri responsabile dell’interazione elettrostaticamente con la superficie anionica dei batteri. Trattandosi di una recente scoperta e non essendoci in letteratura studi meccanicistici su tali tipologie di superfici antimicrobiche, il primo obiettivo del mio progetto di dottorato è stato quello di valutare se l’attività antimicrobica ed emolitica dei film PEG(MMA-DMAEMA)n fosse influenzata dalla modifica dei tre principali componenti dei copolimeri ossia: dal bilancio tra densità di carica ed idrofobicità, dall’architettura polimerica e dalla modifica del pendaglio amminico protonabile. Tenendo conto di tali componenti sono state sviluppate due nuove serie di superfici insolubili del tipo PEG(MMA-AAEMA)n costituite dalle architetture A(BC), A(BC)2 e A(BC)4 con diverso rapporto tra densità di carica (AAEMA) e idrofobicità (MMA) e diverso sostituente sull’atomo di azoto nei monomeri AAEMA (Metile, Etile, ter Butile, iso propile). E’ stato dimostrato che l’attività antimicrobica dei copolimeri dipende esclusivamente dalla densità di carica superficiale e non dalla loro componente idrofobica ed inoltre, essi sono biocompatibili in quanto non inducono attività emolitica. Il secondo obiettivo di questo progetto è stato quello di studiare il meccanismo d’azione con il quale tali copolimeri agiscono sulle cellule batteriche. In particolare, è stata studiata l’interazione dei films con il batterio gram negativo Escherichia coli dimostrando che, a seguito del contatto con i copolimeri, subisce una significativa alterazione della permeabilità della barriera esterna. I films sono in grado di danneggiare le cellule batteriche già dopo 30 minuti di trattamento ma, tale alterazione, diventa irreversibile e letale soltanto per trattamenti maggiori di 60 minuti. L’ azione battericida dei copolimeri, inoltre, non dipende da una risposta cellulare ne è mediata da un ruolo attivo della parete batterica in quanto agiscono direttamente sulle membrane cellulari. Tuttavia, essendo costituiti da pendagli non sufficientemente lunghi da poter raggiungere e distruggere la membrana citoplasmatica è stato ipotizzato che i copolimeri, a seguito dell’interazione con la superficie batterica, interagiscono inizialmente con le molecole anioniche di LPS causandone il rilascio e di conseguenza la perdita di stabilità della membrana esterna. Questi risultati hanno fornito prove sufficienti per poter ipotizzare il meccanismo d’azione delle nuove superfici antimicrobiche PEG(MMA-AAEMA)n. [a cura dell'autore]
2013 - 2014
2017-03-28T00:00:00ZIdentification of new genetic alterations and potential biomarkers in papillary thyroid carcinomaEsposito, Robertahttp://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/24752019-05-30T12:26:49Z2016-05-24T00:00:00ZIdentification of new genetic alterations and potential biomarkers in papillary thyroid carcinoma
Esposito, Roberta
Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most frequent thyroid malignant
neoplasia. Oncogene activation occurs in more than 70% of the cases. BRAF
mutations occur in about 40% of PTCs, whereas RET rearrangements (RET/PTC
oncogenes) are present in about 20% of cases. Finally, RAS mutations and TRK
and PPARG rearrangements account for about 5% each of these malignancies.
However, despite the presence of tumor-initiating driver events, cancer results
from the progressive accumulation of mutations in genes that confer growth
advantage over surrounding cells. A better understanding of molecular alterations
of PTC will provide important insights into cancer etiology. It will also lead to
advance in their diagnosis, possibly opening the way for developing novel
molecular therapies.
Thus, the aim of this PhD project is to deeply explore the transcriptome of PTC in
order to identify new driver events in this type of cancer.
In the first part of this study, we used RNA-Sequencing in a discovery cohort of
18 patients with papillary thyroid carcinoma to identify fusion transcripts and
expressed mutations in cancer driver genes. Furthermore, we used targeted
sequencing on the DNA of these same patients to validate identified mutations.
We extended the screening to thyroids of 50 PTC patients and of 30 healthy
individuals. Using this approach we identified new somatic mutations in CBL,
NOTCH1, PIK3R4 and SMARCA4 genes. We also found mutations in DICER,
MET and VHL genes, previously found mutated in other tumors, but not
described yet in PTC. We also identified a new chimeric transcript generated by
the fusion of lysine deficient protein kinase 1 (WNK1) and beta-1,4-N-acetylgalactosaminyl
transferase 3 (B4GALNT3) genes and correlated with an
overexpression of B4GALNT3 gene.
Moreover, although protein coding genes play a leading role in cancer genetics,
in recent years, many studies focused on a novel class of non coding RNAs, long
non coding RNAs (lncRNAs), which regulate the expression levels of protein
coding genes. Since deregulated expression of lncRNAs has been reported in
many cancers, it suggests that that they may act as potential oncogene or tumorsuppressor.
Thus, to assess if lncRNAs can exert a tumorigenic role in thyroid, in the second
part of my PhD project I systematically quantified lncRNAs’ expression in PTC vs
healthy thyroids using our RNA-Seq data. Combining ab initio reconstruction to a
custom computational pipeline we found that novel and known lncRNAs are
significantly altered in PTC, and some of them are possibly associated with
cancer driver genes. Then we extensively focused on an unannotated lncRNA
transcribed antisense to MET oncogene, named in this study MET-AS. Both
genes are significantly up-regulated in a sub-class of PTCs - i.e. patients with
BRAF gene mutations and RET gene rearrangements, compared to other PTCs
and "non-tumor" thyroid biopsies. Preliminary data indicate that MET-AS
knockdown induces down-regulation of MET, and induces a changes in cell cycle
in a PTC cell line, suggesting the novel lncRNA might be a new MET regulator.
Further studies should be conducted to demonstrate detailed mechanism of our
findings.
Finally, our data confirmed the genetic heterogeneity of papillary thyroid
carcinoma revealing that gene expression correlates more with the mutation
pattern than with tumor staging. Overall, this study provides new information
about PTC genetic alterations, suggesting potential pharmacological adjuvant
therapies in PTC. [edited by author]; Il carcinoma papillare tiroideo (PTC) costituisce circa l’80% di tutti i tumori
maligni della tiroide. Ad oggi, sono state identificate mutazioni a carico del gene
BRAF in circa il 40% di casi, mentre riarrangiamenti che coinvolgono il gene
RET (RET/PTC) sono presenti in circa il 20% dei casi. Infine, mutazioni nei geni
RAS e riarrangiamenti dei geni TRK e PPARG occorrono in circa il 5% dei casi
ciascuno.
Tuttavia, nonostante la presenza di alterazioni genetiche che possano dare
inizio al processo canceroso, il tumore è il risultato del progressivo accumulo di
mutazioni in geni che conferiscono un vantaggio di crescita sulle cellule
circostanti. Pertanto, una conoscenza più approfondita delle alterazioni
molecolari del carcinoma papillare tiroideo è fondamentale per migliorare gli
aspetti diagnostici e prognostici, e la risposta individuale ai trattamenti
farmacologici.
Alla luce di ciò, il mio progetto di dottorato ha avuto come obiettivo principale
l’analisi del trascrittoma del PTC al fine di individuare nuovi eventi molecolari
che possano essere implicati in questo tipo di cancro.
La prima parte di questo progetto è stata focalizzata sul sequenziamento -
mediante RNA-Seq – di 22 RNA isolati da biopsie di tiroide (18 tiroidi affette da
carcinoma papillare tiroideo, 4 tiroidi non tumorali) per identificare trascritti di
fusione e mutazioni somatiche in geni espressi. I risultati sono stati validati sul
DNA dei medesimi pazienti mediante sequenziamento diretto di Sanger. Inoltre,
l’analisi mutazionale è stata estesa ad ulteriori 50 pazienti affetti da carcinoma
papillare tiroideo e 30 individui sani. Mediante quest’approccio sono state
identificate nuove mutazioni puntiformi nei geni CBL, NOTCH1, PIK3R4 e
SMARCA4. Inoltre, l’analisi ha rivelato la presenza di mutazioni somatiche nei
geni DICER1, MET e VHL, già note nella patogenesi in altri tipi di cancro, ma ad
oggi non note nel PTC. Inoltre, è stato individuato un nuovo evento di fusione
intra-cromosomico generato dalla fusione tra il primo esone del gene WNK1
(lysine deficient protein kinase 1) e il secondo esone del gene B4GALNT3
(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 3).
I geni codificanti rivestono un ruolo di primo piano nella genetica del cancro, ma
negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su una nuova classe di RNA non
codificanti, i long non coding RNA (lncRNAs), che regolano l’espressione dei
geni codificanti. I livelli di espressione dei lncRNA sono spesso alterati in diversi
tipi di tumori, suggerendo che essi possano agire sia da oncogeni sia da
oncosoppressori. Al fine di valutare il loro potenziale ruolo nella tumorigenesi
del PTC, la seconda parte di questo progetto è stata focalizzata sull’analisi
computazionale dei lncRNA, sia nuovi che annotati, nei nostri dataset di RNASeq.
Attraverso l’utilizzo di approcci per la ricostruzione ab initio del trascrittoma
e di una pipeline computazionale sono stati indentificati i lncRNA
significativamente deregolati nei campioni tumorali. Inoltre, per individuare i
lncRNA che potessero regolare l’espressione genica in cis, alcuni di essi sono
stati associati - per vicinanza al TSS (transcription start site) - a geni driver in
diversi tipi di cancro. Infine, mi sono focalizzata su un lncRNA non annotato nei
database pubblici, associato all’oncogene MET, ma trascritto dal filamento
opposto. Si tratta pertanto di un lncRNA antisenso al gene MET, chiamato in
questo lavoro di tesi MET-AS. Entrambi i geni sono significativamente sovraespressi
in una sotto-classe di PTC - vale a dire i pazienti con mutazioni del
gene BRAF e riarrangiamenti dell’oncogene RET – chiamati BRAF-like-,
rispetto ai campioni tumorali PTC, con profilo trascrizionale simile ai campioni
mutati nei geni RAS – chiamati RAS-like - e campioni di tiroide "non-tumorali".
Esperimenti preliminari condotti in vitro su una linea cellulare di carcinoma
papillare tiroideo, TPC-1, indicano che il silenziamento del lncRNA MET-AS
induce una down-regolazione dell’oncogene MET, e induce un blocco del ciclo
cellulare in fase G1, suggerendo che il lncRNA potrebbe essere un nuovo
regolatore dell’oncogene MET.
In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi confermano
l'eterogeneità genetica del carcinoma papillare della tiroide rivelando che
l'espressione genica correla più con il profilo mutazionale dei pazienti che con la
stadiazione del tumore. Inoltre, questo studio fornisce nuove informazioni sulle
alterazioni genetiche del PTC, suggerendo potenziali terapie adiuvanti
farmacologiche per questo tipo di cancro. [a cura dell'autore]
2014 - 2015
2016-05-24T00:00:00Z