http://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/6246 2026-04-20T08:49:08Z http://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/7430 Development and application of omics technologies for the monitoring of personalized therapeutic protocols Merciai, Fabrizio During the 1st year the scientific activity was focused on the development of an experimental protocol aimed to evaluate the possible involvement of Sortilin (Sort), a membrane glycoprotein, in the modulation of sphingolipids pathway in the field of hypertension. Lipid profiling was carried out through targeted and untargeted approaches. In detail, a targeted lipidomic study was performed to investigate a potential correlation between the plasma levels of Sort and of Sphingosine-1-phosphate (S1P), Ceramide C16, Ceramide C18, Ceramide C24:1. The extraction protocol and the analytical method were optimized on human umbilical vein endothelial cells lines and, subsequently, applied to a small cohort of normotensive and hypertensive patients. The results showed a possible relationship between the plasma levels of Sort and S1P, identifying the latter one as co-responsible for the high levels of blood pressure observed. Then, in order to take a fast snapshot to the lipidome of hypertensive patients, a rapid DI-FT-ICR method was optimized. A preliminary statistical analysis highlighted different sphingolipids, such as sphinganines and deoxy-ceramides, dysregulated in hypertensive subjects. Subsequently, during the 2nd year, to corroborate the role of sphingolipids and Sort in hypertension, a large-scale study was conducted on 270 patients, enrolling normotensives, controlled hypertensives and uncontrolled hypertensives. The results confirmed the indications obtained from the pilot study. Indeed, a statistically significant increase and a linear correlation were observed in the S1P and Sort plasma levels of hypertensive patients’ group. Furthermore, hypertension represents one of the risk factors for the onset of inflammatory pathologies of the vessel wall, such as atherosclerosis. For this purpose, the untargeted analytical method previously developed (nano-DI-FT-ICR) was applied to evaluate the effect of a novel antihypertensive Spirulina peptide, namely SP6, in the modulation of atherosclerosis progression in HFD ApoE−/− mice model. Statistical analysis put in evidence several dysregulated pathways, such as: sphingolipids and glycerophospolipids metabolism, fatty acid biosynthesis, tricarboxylic acid cycle (TCA) and glutamate/glutamine metabolism. In the 3rd year, trapped ion mobility mass spectrometry (TIMS) was employed to investigate both a genetic syndrome, like adaptor protein 4 (AP-4) associated hereditary spastic paraplegia (HSP), and a viral disease, such as SARS-CoV-2. AP4-deficient neurons are characterized by axonal growth defects. During my period as visiting scientist at Max Planck Institute (MPI), the application of a spatial proteomics platform proposed the diacylglycerol lipase-beta (DAGLB), a key enzyme for generation of 2-arachidonoylglycerol (2-AG), as a novel AP-4’s cargo protein. We found that levels of 2-AG were significantly reduced in the brains of AP-4 deficient mice, confirming DAGLB as a novel AP-4 cargo protein responsible with 2-AG of the abnormal axonal growth. The identification of possible prognostic biomarkers, which may predict the course of the disease, it’s one of the main lipidomics tasks. Thus, we hypothesize that metabolic changes in COVID-19 plasma patients are earlier than clinical changes and, therefore, potentially exploitable for early prognostic assessment. So, we evidenced a significant and progressive decrease of Lysophosphatidylcholines and ether-linked Lysophosphatidylcholines already at the time of admission, unveiling their capability to predict COVID-19 patients’ outcome. During the 3rd year at MPI, we adapted the EvosepOne LC system to lipidomics challenges and evaluated its performance in combination with TIMS-qTOF. This platform allowed to maintain benefits from both nano-ionizations sensitivity and high flow rates throughput (1µL/min). The EvosepOne elutes sample from disposable trap columns to reduce carry-over issue, and embeds the analytes in a pre-formed gradient, which is then pushed through the separation column with a single high-pressure pump. Our results show new perspectives for high-throughput and in-depth lipidomics in biomedical research using a novel nanoflow LC system and a TIMS-qTOF. [edited by Author]; Durante il primo anno di dottorato l’attività scientifica è stata finalizzata a sviluppare un protocollo sperimentale teso a valutare il possibile coinvolgimento della Sortilina (Sort), una glicoproteina di membrana, nella modulazione del pathway degli sfingolipidi nell’ambito dell’ipertensione. L’analisi lipidomica è stata condotta mediante un approccio mirato (targeted) ed uno hypothesis-free (untargeted). Nel dettaglio, lo studio di lipidomica targeted ha valutato la possibile correlazione tra i livelli plasmatici di Sort e degli sfingolipidi: Sfingosina-1-fosfato (S1P), Ceramide C16, Ceramide C18, Ceramide C24:1. Il protocollo analitico-estrattivo è stato ottimizzato a partire da cellule endoteliali di vena ombelicale umana e, successivamente, applicato ad una piccola coorte di pazienti normotesi ed ipertesi. I risultati hanno evidenziato una possibile correlazione tra i livelli plasmatici di Sort e S1P, identificando quest’ultima come co-responsabile degli alti livelli di pressione arteriosa. Successivamente, al fine di ottenere informazioni circa le possibili alterazioni lipidiche nel plasma di pazienti ipertesi, è stato ottimizzato un metodo di infusione diretta con l’impiego del sistema FT-ICR. L’analisi statistica preliminare ha evidenziato, in soggetti ipertesi, alterazioni nei livelli plasmatici di alcuni sfingolipidi, come sfinganine e deossi-ceramidi. Nel corso del secondo anno di dottorato, per rafforzare l’ipotesi circa il coinvolgimento degli sfingolipidi e della sortilina nell’ipertensione, è sato condotto uno studio su una coorte più numerosa di soggetti. Quest’ultima ha arruolato 270 pazienti equamente divisi in: normotesi ed ipertesi responsivi o meno al trattamento farmacologico. I risultati hanno confermato le indicazioni ottenute dallo studio pilota. Infatti, è stato osservato un aumento statisticamente significativo delle concentrazioni plasmatiche di Sort e S1P nel plasma di soggetti ipertesi. L’ipertensione rappresenta inoltre uno dei principali fattori di rischio per l’insorgenza di patologia infiammatorie, come l’aterosclerosi. Per tal motivo, il metodo per l’analisi untargeted (nano-FT-ICR) precedentemente sviluppato, è stato applicato per monitorare gli effetti di un nuovo peptide ad attività antiipertensiva, rinominato SP6, nella modulazione dell’aterosclerosi in modelli di topi ApoE−/− . L’analisi statistica ha messo in luce alcuni pathways su cui sembra agire SP6, ossia: il metabolismo di sfingolipidi e glicerofosfolipidi, la biosintesi degli acidi grassi, il ciclo degli acidi tricarbossilici ed il metabolismo di glutammato e glutammina. Nel corso del terzo anno di dottorato, la trapped ion mobility mass spectrometry (TIMS) è stata impiegata per valutare alterazioni lipidiche connesse sia ad una grave forma di paraplegia spastica ereditaria quale la sindrome da carenza del complesso AP-4, sia ad una patologia virale come l’infezione da SARS-CoV-2. I neuroni di pazienti affetti dalla sindrome di carenza del complesso AP-4 presentano delle alterazioni strutturali dovute a difetti nella crescita degli assoni. Recenti studi hanno candidato la diacilgicerolo-lipasi-beta (DAGLB), l’enzima chiave per la generazione del 2- arachidonoilglicerolo (2-AG), come una nuova possibile proteina cargo di AP-4. L’attività di ricerca ha permesso di osservare livelli cerebrali di 2-AG significativamente più bassi in topi carenti del complesso AP-4, confermando così l’ipotesi che la DAGLB sia una nuova proteina cargo di AP-4, responsabile insieme a 2-AG del danno neuronale. L'identificazione di possibili markers prognostici, in gradi di predire il decorso di una patologia, rappresenta uno dei principali obiettivi della lipidomica. Dunque, abbiamo ipotizzato che i cambiamenti metabolici nel plasma di pazienti positivi al Covid-19 possano essere precedenti ai cambiamenti clinici e, perciò, potenzialmente impiegabili per scopi prognostici. Infatti, abbiamo identificato una significativa e progressiva riduzione dei livelli plasmatici di Lisofosfatidilcoline ed Alchil-lisofosfatidilcoline già al momento dell’ospedalizzazione dei pazienti, che sembra quindi poter essere in grado di prevedere l’outcome dei pazienti. Infine, durante l’ultimo di dottorato, abbiamo lavorato per adattare il sistema EvosepOne LC alle sfide della lipidomica e ne abbiamo valutato la performance in combinazione con uno spettrometro di massa TIMS-qTOF. Tale piattaforma cromatografica permette di unire i vantaggi della nanoionizzazione con quelli derivanti dall’impiego di un alto flusso delle fasi mobili (1µL/min). Il sistema EvosepOne LC incorpora gli analiti in un gradiente preformato che è poi spinto attraverso la colonna cromatografica da una singola pompa ad alta pressione. I nostri risultati offrono nuove opportunità per un’analisi lipidomica ad elevate prestazioni nell’ambito della ricerca biomedica. [a cura dell'Autore] 2020 - 2021 2022-05-05T00:00:00Z http://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/7428 Annexin A1 in pancreatic cancer progression Novizio, Nunzia Pancreatic cancer (PC) is one of the most aggressive cancers in the world and it correlates to poor prognosis and high mortality due to late diagnosis, even if early diagnosed. Resectable PC patients have unfavorable outcome due to several factors like chemoresistance by tumor microenvironment (TME) and by tumor cells per se. Recent studies have focused on TME that plays a critical role in PC progression, highlighting the strong relationship between the microenvironment and metastasis. Several extracellular factors are involved in its development and metastasis. In PC, the protein Annexin A1 (ANXA1) appears overexpressed and may be identified as an oncogenic factor, also as component in tumor-deriving extracellular vesicles (EVs). Indeed, these microvesicles are known to nourish the TME. Our published data have highlighted that autocrine/paracrine activities of extracellular ANXA1 depend on its presence in EVs. The aim of the first and second year of my PhD project has been to investigate the paracrine effect of ANXA1 on cellular components of TME, mainly stromal cells like fibroblasts, endothelial ones to demonstrate how the ANXA1- EVs complex can stimulate this mechanism. EVs from Wild Type (WT) and ANXA1- Knock-Out (KO) MIA PaCa-2 cells, obtained by CRISPR/Cas9 genome editing system, have been purified from cell conditioned medium by differential centrifugation and then administrated on stromal cells. Moreover, as oncogenic factor, ANXA1 needs to be inhibited, mainly by blocking its extracellular form, as a new model of cancer adjuvant therapy. Heparan sulfate (HS) is a glycosaminoglycan of the extracellular matrix known to bind growth factors and cytokines, generating a kind of reservoir in the extracellular environment. One of these molecules is represented by ANXA1 and previous study has shown that ANXA1 notably binds to sulfate glycans, mainly HS and heparin. In this regard, the second annual aim has been to investigate the interaction between HS and ANXA1 and how this glycosaminoglycan could influence ANXA1 oncogenic action. In this way, it would be possible to confirm the relevance of ANXA1 in PC progression as actor of the cross-talk among tumor cells and the microenvironment. In order to amplify the knowledge about the role of ANXA1 on PC stroma, the aim of my third year has been to demonstrate that the complex ANXA1/EVs modulates the macrophage polarization further contributing to cancer progression. The WT and ANXA1 KO EVs have been administrated to THP-1 macrophages finding that ANXA1 is crucial for the acquisition of a pro-tumor M2 phenotype. The M2 macrophages activate endothelial cells and fibroblasts to induce angiogenesis and matrix degradation, respectively. Once shown in vitro the multifaceted role of ANXA1 in the intensification of PC-stroma cells cross-talk, we have also found a significantly increased presence of M2 macrophage in mice tumor and liver metastasis sections previously obtained by orthotopic xenografts with WT cells. Finally during the third year of the PhD program, I had the opportunity to work at “Institut national de la santé et de la recherche médicale” (INSERM), Marseille (FR), where I deepened the role of ANXA1 in TME using tumor 3D model, both in monoculture and co-culture with cancer associated fibroblasts (CAFs) and monocytes. Taken together, our data interestingly suggest the relevance of ANXA1 as potential diagnostic/prognostic and/or therapeutic PC marker. In this way, it would be possible to confirm the relevance of ANXA1 in PC progression as actor of the cross-talk among tumor cells and the microenvironment. [edited by Author]; Il cancro al pancreas (CP) è uno dei tumori più aggressivi al mondo ed è correlato a prognosi sfavorevole e mortalità elevata soprattutto a causa della diagnosi tardiva, tuttavia anche se diagnosticato precocemente. I pazienti con CP resecabili hanno un esito sfavorevole a causa di diversi fattori come la chemioresistenza dovuta sia alle cellule tumorali che al microambiente tumorale (TME). Recenti studi si sono concentrati sul TME che svolge un ruolo critico nella progressione del CP, evidenziando una forte correlazione tra il microambiente e lo sviluppo di metastasi. Inoltre diversi fattori extracellulari sono coinvolti nel suo sviluppo e metastasi. Nel CP, la proteina Annessina A1 (ANXA1) appare sovraespressa e può essere identificata come fattore oncogenico, anche come componente delle vescicole extracellulari tumorali (EV). In effetti, queste microvescicole sono note per sostenere il TME. I nostri dati pubblicati hanno evidenziato che le attività autocrine/paracrine di ANXA1 extracellulare dipendono anche dalla sua presenza negli EV. L'obiettivo del primo e del secondo anno del mio progetto di dottorato è stato quello di studiare l'effetto paracrino di ANXA1 sui componenti cellulari del TME, principalmente cellule stromali come i fibroblasti e cellule endoteliali per dimostrare come il complesso ANXA1-EVs può stimolare la progressione tumorale. Gli EV isolati da cellule MIA PaCa-2 Wild Type (WT) e ANXA1-Knock-Out (KO), queste ultime ottenute grazie al sistema di editing del genoma CRISPR/Cas9, sono stati purificati dal mezzo condizionato cellulare mediante centrifugazione differenziale e poi somministrati su cellule stromali. Inoltre l'ANXA1, come fattore oncogenico, deve essere inibita, principalmente bloccando la sua forma extracellulare, e questo può considerarsi come nuovo modello di terapia adiuvante del cancro. L'eparan solfato (HS) è un glicosaminoglicano della matrice extracellulare noto per legare fattori di crescita e citochine, generando una sorta di riserva nell'ambiente extracellulare. Una di queste molecole è rappresentata da ANXA1 e studi precedenti hanno dimostrato che ANXA1 si lega in particolare ai glicani solfati, principalmente HS ed eparina. A tal proposito, il secondo obiettivo annuale è stato quello di studiare l'interazione tra HS e ANXA1 e come questo glicosaminoglicano potrebbe influenzare l'azione oncogenica di ANXA1. Così, sarebbe possibile confermare la rilevanza di ANXA1 nella progressione del CP come attore del cross-talk tra le cellule tumorali e il microambiente. Al fine di ampliare le conoscenze sul ruolo di ANXA1 sullo stroma del CP, l'obiettivo del mio terzo anno è stato quello di dimostrare che il complesso ANXA1/EV modula la polarizzazione dei macrofagi contribuendo ulteriormente alla progressione del cancro. Gli EV WT e ANXA1 KO sono stati somministrati ai macrofagi, ottenuti da monociti THP-1, e si è visto che ANXA1 è cruciale per l'acquisizione di un fenotipo M2 protumorale. I macrofagi M2, a loro volta, sono in gradi di attivare le cellule endoteliali e i fibroblasti per indurre rispettivamente l'angiogenesi e la degradazione della matrice. Una volta mostrato in vitro il ruolo di ANXA1 nell'intensificazione del cross-talk delle cellule CP-stroma, abbiamo anche riscontrato una presenza significativamente aumentata dei macrofagi M2 nelle sezioni tissutali di tumore e metastasi epatiche precedentemente ottenute da xenotrapianti ortotopici di cellule MIA PaCa-2 WT e ANXA1 KO in topo. Infine durante il terzo anno del Dottorato, ho avuto l'opportunità di lavorare presso “Institut national de la santé et de la recherche médicale” (INSERM), Marsiglia (FR), dove ho approfondito il ruolo di ANXA1 nel TME utilizzando modelli 3D tumorali, sia in monocoltura che in co-coltura con fibroblasti associati al cancro (CAF) e monociti. Presi insieme, i nostri dati suggeriscono in modo interessante l’importanza di ANXA1 come potenziale marcatore diagnostico/prognostico e/o terapeutico del CP. In questo modo, sarebbe possibile confermare la rilevanza di ANXA1 nella progressione del CP, come attore nel cross-talk tra le cellule tumorali e il microambiente. [a cura dell'Autore] 2020 - 2021 2022-02-02T00:00:00Z http://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/7319 A multi-disciplinary approach based on mass spectrometry to disclose the potential of phytoextracts as natural cosmetics Ceccacci, Sara Plant cells represent a valid source of cosmetic ingredients since their extracts can be considered bio-sustainable, contaminant-free and standardized secondary metabolites mixtures (Barbulova et al., 2014). This PhD project has met the interest of Arterra Bioscience S.p.A in performing a broad chemical and biological characterization of some plant cell extracts in the prospective to exploit them as cosmetic ingredients. In particular, we focused on the hydrophilic extract of Oenothera biennis cells (ObHEx) and on the hydroethanolic extract of Jasminum sambac cells (JasHEx). The mass spectrometry-based chemical characterization was performed using Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)(M. Wang et al., 2016) as bioinformatics tool for data organization and annotation. The biological activity of the extracts was evaluated by a panel of in vitro (global proteomics analysis and cell-based assays) and ex vivo experiments. Interesting secondary metabolites were identified in ObHEx: they belong to lignans (salvadoraside and liriodendrin) and triterpenes (myrianthic acid, arjunolic acid, asiatic acid and hederagenin), some of which previously associated with pro-collagen I production in human fibroblasts (Bonte et al., 1994; Farwick et al., 2014). Indeed, bioassays revealed that ObHEx is able, by increasing Myosin light chain kinase (MYLK) gene expression, to promote matrix collagen contraction, actin polymerization and the production of extracellular matrix proteins (Ceccacci et al., 2021). Moreover, global proteomics experiments, performed during my period as visiting PhD student at the Proteomics Platform of the INSERM US24, proved a pro-mitotic mechanism of action of ObHEx on senescent human dermal fibroblasts: it stimulates the re-entry into cell cycle of senescent cells via increase of mitotic protein expression (Ceccacci et al., 2022b). JasHEx is principally composed by phenolic acid derivatives, lignans (secoisolariciresinol, nortrachelogenin and matairesinol) and triterpenes (arjunolic acid, asiatic acid, maslinic acid, oleanolic acid and ursolic acid) (Ceccacci et al., 2022a). Biological experiments, carried out during my research period at Arterra Bioscience SpA, proved that JasHEx is able to reduce cytosolic reactive oxygen species production in stressed keratinocytes. It also showed anti-glycation activity and an extracellular matrix booster effect, by increasing collagen type I synthesis. In particular, the antioxidant properties of JasHEx were related not only to its free radical scavenging and metal chelating activities, but also to the enhancement of Nrf2/ARE pathway. This latter also explains JasHEx anti-inflammatory activity which decreased nitric oxide levels in LPS stimulated macrophages. Thus, on the basis of these results, both extracts can be considered as powerful cosmetic bioactive ingredients to counteract skin aging. [edited by the Author]; Le cellule vegetali rappresentano una valida fonte di ingredienti cosmetici, dal momento che i loro estratti possono essere considerati miscele di metaboliti secondari biosostenibili, prive di contaminanti e standardizzate (Barbulova et al., 2014). Questo progetto di dottorato ha risposto all'interesse dell’Arterra Bioscience S.p.A di effettuare un'ampia caratterizzazione chimica e biologica di alcuni estratti di cellule vegetali, nella prospettiva di sfruttarli come ingredienti cosmetici. In particolare, ci siamo concentrati sull'estratto idrofilo delle cellule di Oenothera biennis (ObHEx) e sull'estratto idroetanolico delle cellule di Jasminum sambac (JasHEx). La caratterizzazione chimica basata sulla spettrometria di massa è stata eseguita utilizzando Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (M. Wang et al., 2016) come strumento bioinformatico per l'organizzazione e l'annotazione dei dati. L'attività biologica degli estratti è stata valutata mediante esperimenti in vitro (analisi di proteomica globale e saggi in cellula) ed ex vivo. Interessanti metaboliti secondari sono stati identificati in ObHEx: essi appartengono a lignani (salvadoraside e liriodendrina) e triterpeni (acido miriantico, acido arjunolico, acido asiatico ed hederagenina), alcuni dei quali precedentemente associati alla produzione di pro-collagene I nei fibroblasti umani (Bonte et al., 1994; Farwick et al., 2014). Infatti, i saggi biologici hanno rivelato che ObHEx, aumentando l'espressione genica della chinasi della catena leggera della miosina (MYLK), è in grado di promuovere la contrazione del collagene della matrice, la polimerizzazione dell'actina e la produzione delle proteine extracellulari della matrice (Ceccacci et al., 2021). Inoltre, gli esperimenti di proteomica globale, eseguiti durante il mio periodo di ricerca presso la Piattaforma di Proteomica dell'INSERM US24, hanno dimostrato che ObHEx esercita un meccanismo di azione pro-mitotico sui fibroblasti dermici umani senescenti: esso stimola il rientro nel ciclo cellulare delle cellule senescenti attraverso l'aumento dell'espressione di alcune proteine mitotiche (Ceccacci et al., 2022b). JasHEx è composto principalmente da derivati dell'acido fenolico, lignani (secoisolariciresinolo, nortrachelogenina e matairesinolo) e triterpeni (acido arjunolico, acido asiatico, acido maslinico, acido oleanolico e acido ursolico) (Ceccacci et al., 2022a). Esperimenti biologici, condotti durante il mio periodo di ricerca presso Arterra Bioscience S.p.A, hanno dimostrato che JasHEx è in grado di ridurre la produzione di specie reattive dell’ossigeno in cheratinociti stressati con H2O2. Ha anche mostrato attività anti-glicazione e un effetto booster della matrice extracellulare, aumentando la sintesi di collagene di tipo I. In particolare, le proprietà antiossidanti di JasHEx sono correlate non solo alle sue attività “scavenging” dei radicali liberi e di chelazione dei metalli, ma anche alla stimolazione del pathway Nrf2/ARE. Ciò giustifica anche l'attività anti-infiammatoria di JasHEx che ha ridotto i livelli di ossido nitrico in macrofagi stimolati con LPS. Pertanto, sulla base di questi risultati, entrambi gli estratti possono essere considerati come potenti principi bioattivi cosmetici per contrastare l'invecchiamento della pelle. [a cura dell'Autore] The PhD scholarship was co-financed with resources from Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I “Capitale Umano”, Azione I.1 “Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale”.; 2021 - 2022 2023-04-09T00:00:00Z http://elea.unisa.it/xmlui/handle/10556/6587 Development and Evaluation of Innovative Stationary Phases for Separation of Pharmaceuticals, Metabolites and Biocompounds Grasso, Giuliana Biofluids are typical complex matrices representing a source of potential biomarkers, but often require high demands in sample preparation prior to analysis. With this purpose, several techniques have been developed including solid phase extraction and methods based on the molecular recognition, such as immuno-affinity sorbents and molecularly imprinted polymers. Lipidomics is a research field in which it is needed to develop efficient techniques for sample pre-treatment in order to obtain reliable and reproducible results. Lipids are involved in many processes, as cellular structures, signaling, within the cell and between cells, and energy storage. Because of the role of lipids and all their functions, the field of Lipidomics is emerging with the focus on identifying alterations in lipids metabolism and lipid-mediated signalling processes that regulate cellular homeostasis and trying to understand the relationship between these processes in health and disease (Han & Gross, 2003). .. [edited by the Author] 2018 - 2019 2020-09-18T00:00:00Z