Physico-chemical characterization of DNA G-quadruplexes and their interaction with proteins and potential anticancer agents

Abstract

Negli ultimi anni è stato dimostrato che sequenze di DNA (o RNA) ricche in guanine sono in grado di formare una nuova classe di strutture: le quadruple eliche. Importante e' la presenza di quadruple eliche in regioni promotrici e regolatrici di molti geni e nella parte terminale dei cromosomi, i telomeri. Recentemente, lo studio di queste molecole ha avuto un notevole sviluppo grazie alle diverse applicazioni che esse potrebbero avere in campo medico e farmaceutico. In particolare, le quadruple eliche hanno una potenziale applicazione nella terapia anticancro quali inibitori della telomerasi, un enzima la cui iperattività è sicuramente collegata allo sviluppo del cancro. Un promettente approccio per inibire l’attività della telomerasi riguarda l’utilizzo di agenti che possano legare e stabilizzare le quadruple eliche presenti ai telomeri bloccando, in tal modo, l’attività catalitica dalla telomerasi ed agendo da antitumorali. Inoltre, è stato scoperto che oligonucleotidi con struttura a quadrupla elica possono agire da aptameri, cioè hanno la capacità di legare specificamente delle proteine bersaglio, inibendole. L’aptamero denominato TBA (Thrombin Binding Aptamer) è un oligomero a DNA con struttura a quadrupla elica, scoperto in vitro, che è in grado di legare la trombina inibendone la funzione. Il TBA per le sue proprietà anticoagulanti è stato oggetto di numerosi studi sia di tipo strutturale sia di natura farmacologica. L’attività anticoagulante del TBA in vitro è tale da giustificare un suo eventuale impiego in terapia, ma purtroppo tale attività risulta piuttosto bassa in vivo poichè il DNA è rapidamente degradato dalle nucleasi. Uno degli obiettivi di questa tesi di dottorato è stato quello di affrontare uno studio chimico-fisico di composti che sono in grado di legarsi in maniera specifica alle quadruple eliche e dei fattori che regolano gli equilibri in gioco; tali composti sono, infatti, in grado di incrementare la stabilità di questi sistemi e di conseguenza ne possono aumentare l’effetto terapeutico. Per questo motivo è stata studiata la termodinamica dell’interazione di alcune molecole di interesse farmacologico, quali la distamicina, due suoi derivati e la porfirina cationica, con diverse quadruple eliche. Le quadruple eliche prese in esame sono state la d[AG3(TTAG3)3] e la [d(TAGGGTTAGGG)]2 che rappresentano due quadruple eliche formate da un diverso troncamento dal DNA telomerico umano e la d[(TGGGGT)]4 formata da una sequenza troncata del DNA telomerico di Oxytricha e Tetrahymena. Un altro obiettivo è stato quello di caratterizzare la stabilità termodinamica del TBA e di un aptamero modificato (mTBA) ed il processo di binding di questi aptameri con la trombina. L’mTBA presenta una modifica chimica in grado di rendere resistente l’aptamero all’azione delle nucleasi che potrebbe rendere concreto un suo eventuale utilizzo come principio attivo di un farmaco anticoagulante. Inoltre, è stato anche affrontato uno studio computazionale di due quadruple eliche bimolecolari formate da sequenze analoghe di RNA e DNA allo scopo di chiarire i motivi per cui si formano due diverse strutture a quadrupla elica ed i fattori che le stabilizzano. Lo studio è stata condotto principalmente attraverso tecniche calorimetriche quali la calorimetria isoterma (ITC), la microcalorimetria differenziale a scansione (DSC), il dicroismo circolare (CD), e metodi computazionali quali meccanica e dinamica molecolare e docking. I risultati ottenuti per i sistemi quadrupla elica-ligando dimostrano che la distamicina ed un suo derivato contenente un anello metil pirrolico in più ed un gruppo ammidico terminale, legano le quadruple eliche in esame, al contrario un secondo derivato della distamicina contenente due anelli metil pirrolici in più ed un gruppo ammidico terminale non ha mostrato avere interazioni specifiche. I parametri termodinamici ottenuti indicano che le interazioni quadrupla elica-ligando sono fortemente influenzate dallo ione presente in soluzione e che anche la stechiometria di legame è dipendente dal tipo di soluzione. Il calcolo dei parametri termodinamici ha mostrato che, sia in sodio che in potassio, il legame della distamicina e del composto I alle quadruple eliche in esame è entropicamente guidato. Questo dato in particolare suggerisce che il binding di queste molecole potrebbe avvenire nei solchi delle quadruple eliche. Inoltre, un risultato particolarmente interessante è che il composto I ha mostrato, in entrambe le soluzioni, una maggiore affinità della distamicina per le quadruple eliche. I risultati ottenuti per l’interazione porfirina-[d(TAGGGTTAGGG)]2 sono in generale accordo con la struttura cristallografica, recentemente riportata, del complesso ed indicano un binding entalpicamente guidato con una stechiometria 2:1. Lo studio della stabilità termodinamica del TBA e del TBA modificato ha rivelato che l’introduzione della modifica aumenta sia la stabilità termica che termodinamica dell’aptamero. Inoltre, i valori delle variazioni di entalpia ed entropia per la dissociazione del TBA modificato risultano più elevati rispetto al TBA, suggerendo una struttura più rigida e la presenza di ulteriori interazioni intramolecolari nell’aptamero modificato. Questi risultati sono stati confermati ed interpretati sulla base dei risultati delle dinamiche molecolari dei due aptameri. I parametri termodinamici del processo di binding del TBA e del TBA modificato con la trombina mostrano che l’interazione è esotermica e che la stechiometria del complesso che si forma è 1:2 (aptamero:proteina). Il TBA modificato risulta però avere una più alta affinità per la trombina e la sua interazione è associata ad una variazione di entalpia maggiormente favorevole. I risultati delle dinamiche molecolari dei complessi suggeriscono che la maggior affinità dell’aptamero modificato sia dovuta essenzialmente ad una migliore interazione con l’esosito II della trombina. Lo studio di dinamica molecolare delle quadruple eliche di RNA e DNA ha evidenziato che la maggiore differenza tra le due molecole deriva dalla presenza del gruppo 2’-OH del ribosio, che contribuisce considerevolmente al numero di legami idrogeno formando più interazioni intramolecolari nella molecola di RNA. I legami che hanno una maggiore persistenza sono quelli formati con l’ossigeno del gruppo fosfato. Questo tipo di legame idrogeno conferisce rigidità alla struttura ed è in parte responsabile della stabilità delle esadi presenti nella quadrupla elica di RNA. Inoltre, durante le simulazioni, gli ioni Na+, inizialmente non direttamente coordinati alle quadruple eliche, vanno a coordinare in modo stabile le macromolecole indicando un possibile meccanismo di coordinazione non ancora osservato sperimentalmente. Parte della ricerca è stata svolta in collaborazione con la Prof. Concetta Giancola del Dipartimento di Chimica dell’Università Federico II di Napoli. Inoltre, una parte dello studio è stato realizzato a Londra presso i laboratori del Prof. Stephen Neidle della School of Pharmacy dell’University of London, e presso il gruppo della Dott. Franca Fraternali, della Randall Division del King’s College London. [a cura dell'autore]