Progettazione, sintesi e valutazione dell'attività biologica di nuovi carbazoli

Abstract

Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso il laboratorio di Fitofarmacia del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università della Calabria e presso il Laboratorio di Farmacognosia dell’Università Paris Descartes di Parigi. L’attività di ricerca è stata dedicata alla sintesi di nuovi carbazoli concepiti come analoghi dello stilbene naturale combretastatina A-4 (CA-4) ed alla successiva valutazione dell’attività biologica in vitro dei composti ottenuti. Presso il Laboratorio di Farmacognosia dell’Università Paris Descartes erano stati già sintetizzati degli analoghi eterociclici della combretastatina A-4, dotati di buona attività biologica. Obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di sintetizzare analoghi dei composti precedentemente ottenuti, apportando ulteriori modifiche strutturali atte a migliorarne le proprietà biologiche, al fine di completare lo studio delle relazioni struttura-attività di questa serie di molecole. Nel corso dei precedenti lavori erano stati sintetizzati dei nuovi 3-aroilindoli, concepiti quali analoghi eterociclici della CA-4 e, successivamente, una serie di 5-(3’,4’,5’-trimetossifenil)pirrolo[3,4-a]carbazoli-1,3(2H,10H)-dioni, concepiti come analoghi cis-blocked dei 3-aroilindoli ed ariltioindoli ottenuti. Alcune di queste molecole avevano mostrato in vitro una buona attività biologica. Obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di sintetizzare nuovi carbazoli, analoghi « aperti » della precedente serie, in modo da ridurre l’ingombro sterico a livello dell’anello benzenico che caratterizzava i carbazoli ed i tetraidrocarbazoli già realizzati, al fine di ottenere dei composti che esplicassero una migliore attività biologica. Il progetto di ricerca ha previsto inizialmente la sintesi di una prima serie di molecole realizzata a partire dall’indolo non sostituito, concepita come modello sperimentale. Per la sintesi delle molecole è stata impiegata una procedura descritta da Noland e collaboratori nel 1996, con qualche opportuna modifica. La realizzazione di questa prima serie di molecole è stata fondamentale, poiché ha consentito di mettere a punto percorsi di sintesi adeguati alla realizzazione di molecole più complesse. Una seconda serie di molecole è stata infatti realizzata, successivamente, a partire dal 6-metossindolo, al fine di ottenere, sulla base di relazioni struttura-attività note, molecole dotate di attività biologica superiore a quella mostrata dalle molecole della prima serie non sostituite. Nel corso del lavoro di tesi sono stati dunque sintetizzati nuovi trimetossifenil-pirroloindolocarbazoli a partire dall’indolo semplice e, in seguito, una seconda serie di molecole a partire dal 6-metossindolo. Molti tentativi sono stati compiuti al fine di ottenere molecole non benzilate sull’anello della maleimide, che fossero caratterizzate da un minor ingombro sterico, ma gli esperimenti non hanno condotto ai risultati attesi. Tale obiettivo è stato raggiunto, infine, realizzando le medesime procedure di sintesi a partire dal 6-bromoindolo: è stato possibile così sintetizzare nuovi composti a partire direttamente dalla maleimide anziché dalla N-benzilmaleimide, e che presentano pertanto un anello aromatico in meno rispetto ai precedenti analoghi. Al fine di valutare la potenziale attività antitumorale legata a proprietà antivascolari delle molecole sintetizzate, si è provveduto alla determinazione della citotossicità in vitro ed alla valutazione degli effetti inibitori sulla polimerizzazione della tubulina. In uno screening iniziale, l’attività antiproliferativa delle molecole sintetizzate è stata testata sulla linea cellulare tumorale B16 (cellule di melanoma murino), mediante il saggio in vitro MTT. Il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) è un saggio colorimetrico ampiamente utilizzato, che permette di misurare la proliferazione e la vitalità cellulare attraverso la valutazione dell'efficienza mitocondriale. La capacità delle molecole di inibire la polimerizzazione della tubulina è stata valutata, invece, utilizzando il colorante fluorescente DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole), impiegando con qualche opportuna modifica la procedura descritta da Barron et al. nel 2003 e da Bane e collaboratori nel 2007. Il colorante degli acidi nucleici DAPI subisce delle modificazioni in termini di fluorescenza in seguito al legame con la tubulina e all’assemblaggio dei monomeri, e le variazioni nell’intensità dell’emissione possono essere impiegati per monitorare la polimerizzazione della proteina. Per completare la valutazione dell’attività biologica dei composti ottenuti sono stati valutati, inoltre, gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali Ea.hy 926, test considerato predittivo di una potenziale attività antivascolare in vivo. I risultati ottenuti hanno consentito di orientare il lavoro di sintesi e di evidenziare le relazioni struttura-attività per le serie di molecole realizzate. L’analisi dell’attività biologica delle molecole sostituite (serie R=OCH3) ha evidenziato ottimi risultati preliminari, coerentemente a quanto da noi ipotizzato sulla base delle relazioni struttura-attività note. Queste molecole sembrerebbero promettenti, infatti, sia per quanto concerne gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali, sia per quanto riguarda l’attività inibitoria sulla polimerizzazione della tubulina. Ottimi risultati sono stati osservati per gli analoghi appartenenti alla serie R=Br, sia per quanto concerne gli effetti antiproliferativi, sia per quanto riguarda gli effetti sulla morfologia delle cellule endoteliali Ea.hy 926. Durante l’ultima parte del lavoro sperimentale, l’attività di ricerca è stata dedicata alla sintesi di nuovi diindolilmetani. I diindolilmetani ed i loro derivati costituiscono un’importante classe di composti eterociclici impiegati dall’industria farmaceutica. Queste molecole sono presenti nelle piante appartenenti alla famiglia delle Cruciferae, e sono note per la loro capacità di promuovere il metabolismo degli estrogeni e di indurre apoptosi in cellule tumorali umane. Allo scopo di sintetizzare nuovi carbazoli che fossero caratterizzati da un minor ingombro sterico, la procedura generale impiegata per la sintesi dei tetraidrocarbazoli è stata applicata utilizzando diversi prodotti di partenza. Queste reazioni non hanno condotto alla sintesi di nuovi carbazoli, ma è stato possibile, tuttavia, osservare la formazione di un nuovo diindolilmetano. Obiettivo seguente è stato dunque quello di migliorare la strategia di sintesi utilizzando una procedura più opportuna, in modo da aumentare le rese di reazione. Nelle fasi successive si è inteso appurare se la stessa procedura potesse essere applicata anche alla sintesi di diindolilmetani sostituiti. L’attività antiproliferativa delle molecole è stata testata su diverse linee cellulari tumorali umane mediante il saggio in vitro MTT. Sono state impiegate, in particolare, due linee cellulari di tumore mammario, MCF-7 (human breast cancer, ormono-dipendente) ed SKBR3 (human breast cancer, ormono-indipendente), ed una linea di tumore prostatico, LNCaP (human prostatic adenocarcinoma). In una seconda fase della valutazione dell’attività biologica si è inteso verificare se l’attività antiproliferativa fosse correlata ad induzione di apoptosi. [a cura dell'Autore]