Development of Innovative Agents for the Treatment of Metabolic Diseases

Abstract

Elevated LDL cholesterol (LDL-C) is an established risk factor in cardiovascular disease, the leading cause of death in the world. To date three main therapeutic strategies have been evaluated to reduce circulating LDL-C including: a) inhibition of critical steps of cholesterol synthesis, b) regulation of hepatic expression of the LDL-receptor (LDLR), and c) inhibition of Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9)-mediated LDLR degradation. Berberine (BBR) is a well known hypolipidemic agent able to upregulate LDLR expression. This alkaloid is also endowed with hypoglycemic, antitumor, antiviral, antioxidant and neuroprotective properties. However, BBR has poor oral bioavailability, is a substrate of P-glycoprotein (P-gp) and can affect the CYP450 system. Therefore, the development of new BBR analogues is encouraged in order to obtain new hypolipidemic compounds with improved pharmacokinetic/pharmacodynamic profile. PCSK9 is a protein that binds LDLR and promotes its lysosomal degradation after internalization. Thus, LDLR cannot be recycled to the hepatic cell surface; on the contrary, the inhibition on PCSK9/LDLR increases hepatic cell-surface LDLR and improves the uptake of the LDL particles by the liver. To date, only two mAbs (alirocumab and evolocumab) directed against PCSK9 have been approved by FDA. However, these drugs need to be administered by injection, are expensive, and these aspects can greatly affect adherence to therapeutic regimen. Therefore, an orally available small molecule inhibitor of PCSK9/LDLR interaction would be a desirable alternative in the management of hyperlipidemia, based on its ease of administration and lower cost. This research project aimed to develop new lipid-lowering agents through two different approaches targeting: a) modulation of LDLR expression, and b) inhibition of PCSK9/LDLR interaction. In this regard, for the first approach a small library of BBR analogues was designed and synthesized with the aim to improve the bioavailability compared to our lead compound, and shed light on the minimal structural requirements for its hypolipidemic action. The cytotoxicity of a small set of synthetized BBR analogues was evaluate by MTT assay on HepG2 and HaCaT cell lines, using BBR as reference compound. The results obtained were used to select three promising BBR analogues 18l, 31 and 25a which were tested to assess their ability to reduce total cholesterol (TCHO) and triglycerides (TG) levels in HepG2 cells after 48h of treatment at 5, 10 and 30M. Compound 25a proved to be the most active one showing at 30 an inhibition rate of about 60% and 88% against TCHO and TG respectively. Finally, increased LDLR expression vs control was observed for 18l and 31 by qRT-PCR analysis. For the second approach, two sets of pyrrole derivatives were rationally designed through molecular docking studies, in order to mimic the critical residues of the LDLR implicated in the interaction with its protein partner PCSK9. Computational studies were performed using the crystallographic structure of the known PCSK9/LDLR inhibitor peptide Pep2-8 bound to PCSK9 (PBD code: 4NMX). For some synthesized putative PCSK9/LDLR inhibitors an in vitro binding assay (SPR) was performed, and two derivatives showed KD lower than that of Pep2-8, used as reference compound. [edited by Author]

Elevati livelli di colesterolo LDL (LDL-C) rappresentano il principale fattore di rischio per le malattie cardiovascolari, la principale causa di morte nel mondo. Ad oggi sono state valutate tre principali strategie terapeutiche per ridurre il LDL-C tra cui: a) inibizione degli step critici della sintesi del colesterolo, b) regolazione dell'espressione epatica del recettore delle LDL (LDLR) e c) inibizione dell’interazione LDLR / proproteina convertasi subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9). La berberina (BBR) è un noto agente ipolipidemizzante in grado di sovraregolare l'espressione di LDLR. Questo alcaloide è inoltre dotato di proprietà ipoglicemizzanti, antitumorali, antivirali, antiossidanti e neuroprotettive. Tuttavia, la BBR ha una scarsa biodisponibilità orale, è substrato della glicoproteina P (P-gp) e può influenzare il sistema CYP450. Pertanto, è incoraggiato lo sviluppo di nuovi analoghi della BBR al fine di ottenere nuovi composti ipolipidemici con un migliore profilo farmacocinetico/farmacodinamico. È noto che in condizioni fisiologiche, l’LDL-C presente in circolo, si lega all’LDLR e il complesso viene endocitato negli epatociti. In seguito, l’LDL-C viene degradato nel lisosoma, mentre l’LDLR viene riportato sulla superficie cellulare. Invece, in presenza della PCSK9, l’LDLR non viene riciclato e l'intero complesso viene indirizzato ai lisosomi; pertanto, l'inibizione dell’interazione PCSK9/LDLR determina un aumento di LDLR sulla superficie degli epatociti e migliora l'assorbimento delle LDL da parte del fegato. Ad oggi, solo due mAbs (alirocumab ed evolocumab) diretti contro PCSK9 sono stati approvati dall’FDA. Tuttavia, questi farmaci devono essere somministrati per via parenterale, sono costosi e questi aspetti possono influenzare notevolmente l'aderenza alla terapia. Pertanto, small molecules, disponibili per via orale e più economiche, in grado di inibire l'interazione PCSK9/LDLR, rappresentano una valida strategia nel trattamento delle dislipidemie. Questo progetto di ricerca è stato incentrato sullo sviluppo di nuovi agenti ipolipemizzanti attraverso due diversi approcci: a) modulazione dell'espressione dell’LDLR e b) inibizione dell'interazione PCSK9/LDLR. Nello specifico, per il primo approccio è stata progettata e sintetizzata una piccola libreria di analoghi della BBR con l'obiettivo di migliorarne la biodisponibilità, e far luce sui requisiti strutturali minimi per la sua azione ipolipidemizzante. La citotossicità di un piccolo insieme di analoghi della BBR sintetizzati è stata valutata mediante saggio MTT sulle linee cellulari HepG2 e HaCaT, utilizzando la BBR come composto di riferimento. I risultati ottenuti sono stati utilizzati per selezionare tre promettenti analoghi, 18l, 31 e 25a che sono stati testati per valutare la loro capacità di ridurre i livelli di colesterolo totale (TCHO) e trigliceridi (TG) nelle cellule HepG2 dopo 48 ore di trattamento a 5, 10 e 30µM. Il composto 25a si è rivelato quello più attivo mostrando a 30µM un tasso di inibizione del 60% e dell'88% dei livelli di TCHO e TG rispettivamente. Infine, i composti 18l e 31 sono stati testati mediante qRT-PCR e sono risultati essere in grado di aumentare l'espressione di LDLR. Al momento sono in corso ulteriori studi per valutarne il meccanismo d’azione e le proprietà farmacocinetiche. Per il secondo approccio, due serie di derivati a scaffold pirrolico sono stati razionalmente progettati attraverso studi di docking molecolare, al fine di mimare i residui critici dell'LDLR implicati nell'interazione con la proteina partner PCSK9. Gli studi computazionali sono stati eseguiti utilizzando la struttura cristallografica della PCSK9 complessata con Pep2-8, un noto inibitore peptidico dell’interazione PCSK9/LDLR (codice PBD: 4NMX). Per un piccolo gruppo di composti sintetizzati è stato eseguito un test di legame in vitro (SPR) e due derivati hanno mostrato una KD di circa 7 volte inferiore rispetto a quella di Pep2-8, usato come composto di riferimento. [a cura dell'Autore]