Annexin A1 in pancreatic cancer progression

Abstract

Pancreatic cancer (PC) is one of the most aggressive cancers in the world and it correlates to poor prognosis and high mortality due to late diagnosis, even if early diagnosed. Resectable PC patients have unfavorable outcome due to several factors like chemoresistance by tumor microenvironment (TME) and by tumor cells per se. Recent studies have focused on TME that plays a critical role in PC progression, highlighting the strong relationship between the microenvironment and metastasis. Several extracellular factors are involved in its development and metastasis. In PC, the protein Annexin A1 (ANXA1) appears overexpressed and may be identified as an oncogenic factor, also as component in tumor-deriving extracellular vesicles (EVs). Indeed, these microvesicles are known to nourish the TME. Our published data have highlighted that autocrine/paracrine activities of extracellular ANXA1 depend on its presence in EVs. The aim of the first and second year of my PhD project has been to investigate the paracrine effect of ANXA1 on cellular components of TME, mainly stromal cells like fibroblasts, endothelial ones to demonstrate how the ANXA1- EVs complex can stimulate this mechanism. EVs from Wild Type (WT) and ANXA1- Knock-Out (KO) MIA PaCa-2 cells, obtained by CRISPR/Cas9 genome editing system, have been purified from cell conditioned medium by differential centrifugation and then administrated on stromal cells. Moreover, as oncogenic factor, ANXA1 needs to be inhibited, mainly by blocking its extracellular form, as a new model of cancer adjuvant therapy. Heparan sulfate (HS) is a glycosaminoglycan of the extracellular matrix known to bind growth factors and cytokines, generating a kind of reservoir in the extracellular environment. One of these molecules is represented by ANXA1 and previous study has shown that ANXA1 notably binds to sulfate glycans, mainly HS and heparin. In this regard, the second annual aim has been to investigate the interaction between HS and ANXA1 and how this glycosaminoglycan could influence ANXA1 oncogenic action. In this way, it would be possible to confirm the relevance of ANXA1 in PC progression as actor of the cross-talk among tumor cells and the microenvironment. In order to amplify the knowledge about the role of ANXA1 on PC stroma, the aim of my third year has been to demonstrate that the complex ANXA1/EVs modulates the macrophage polarization further contributing to cancer progression. The WT and ANXA1 KO EVs have been administrated to THP-1 macrophages finding that ANXA1 is crucial for the acquisition of a pro-tumor M2 phenotype. The M2 macrophages activate endothelial cells and fibroblasts to induce angiogenesis and matrix degradation, respectively. Once shown in vitro the multifaceted role of ANXA1 in the intensification of PC-stroma cells cross-talk, we have also found a significantly increased presence of M2 macrophage in mice tumor and liver metastasis sections previously obtained by orthotopic xenografts with WT cells. Finally during the third year of the PhD program, I had the opportunity to work at “Institut national de la santé et de la recherche médicale” (INSERM), Marseille (FR), where I deepened the role of ANXA1 in TME using tumor 3D model, both in monoculture and co-culture with cancer associated fibroblasts (CAFs) and monocytes. Taken together, our data interestingly suggest the relevance of ANXA1 as potential diagnostic/prognostic and/or therapeutic PC marker. In this way, it would be possible to confirm the relevance of ANXA1 in PC progression as actor of the cross-talk among tumor cells and the microenvironment. [edited by Author]

Il cancro al pancreas (CP) è uno dei tumori più aggressivi al mondo ed è correlato a prognosi sfavorevole e mortalità elevata soprattutto a causa della diagnosi tardiva, tuttavia anche se diagnosticato precocemente. I pazienti con CP resecabili hanno un esito sfavorevole a causa di diversi fattori come la chemioresistenza dovuta sia alle cellule tumorali che al microambiente tumorale (TME). Recenti studi si sono concentrati sul TME che svolge un ruolo critico nella progressione del CP, evidenziando una forte correlazione tra il microambiente e lo sviluppo di metastasi. Inoltre diversi fattori extracellulari sono coinvolti nel suo sviluppo e metastasi. Nel CP, la proteina Annessina A1 (ANXA1) appare sovraespressa e può essere identificata come fattore oncogenico, anche come componente delle vescicole extracellulari tumorali (EV). In effetti, queste microvescicole sono note per sostenere il TME. I nostri dati pubblicati hanno evidenziato che le attività autocrine/paracrine di ANXA1 extracellulare dipendono anche dalla sua presenza negli EV. L'obiettivo del primo e del secondo anno del mio progetto di dottorato è stato quello di studiare l'effetto paracrino di ANXA1 sui componenti cellulari del TME, principalmente cellule stromali come i fibroblasti e cellule endoteliali per dimostrare come il complesso ANXA1-EVs può stimolare la progressione tumorale. Gli EV isolati da cellule MIA PaCa-2 Wild Type (WT) e ANXA1-Knock-Out (KO), queste ultime ottenute grazie al sistema di editing del genoma CRISPR/Cas9, sono stati purificati dal mezzo condizionato cellulare mediante centrifugazione differenziale e poi somministrati su cellule stromali. Inoltre l'ANXA1, come fattore oncogenico, deve essere inibita, principalmente bloccando la sua forma extracellulare, e questo può considerarsi come nuovo modello di terapia adiuvante del cancro. L'eparan solfato (HS) è un glicosaminoglicano della matrice extracellulare noto per legare fattori di crescita e citochine, generando una sorta di riserva nell'ambiente extracellulare. Una di queste molecole è rappresentata da ANXA1 e studi precedenti hanno dimostrato che ANXA1 si lega in particolare ai glicani solfati, principalmente HS ed eparina. A tal proposito, il secondo obiettivo annuale è stato quello di studiare l'interazione tra HS e ANXA1 e come questo glicosaminoglicano potrebbe influenzare l'azione oncogenica di ANXA1. Così, sarebbe possibile confermare la rilevanza di ANXA1 nella progressione del CP come attore del cross-talk tra le cellule tumorali e il microambiente. Al fine di ampliare le conoscenze sul ruolo di ANXA1 sullo stroma del CP, l'obiettivo del mio terzo anno è stato quello di dimostrare che il complesso ANXA1/EV modula la polarizzazione dei macrofagi contribuendo ulteriormente alla progressione del cancro. Gli EV WT e ANXA1 KO sono stati somministrati ai macrofagi, ottenuti da monociti THP-1, e si è visto che ANXA1 è cruciale per l'acquisizione di un fenotipo M2 protumorale. I macrofagi M2, a loro volta, sono in gradi di attivare le cellule endoteliali e i fibroblasti per indurre rispettivamente l'angiogenesi e la degradazione della matrice. Una volta mostrato in vitro il ruolo di ANXA1 nell'intensificazione del cross-talk delle cellule CP-stroma, abbiamo anche riscontrato una presenza significativamente aumentata dei macrofagi M2 nelle sezioni tissutali di tumore e metastasi epatiche precedentemente ottenute da xenotrapianti ortotopici di cellule MIA PaCa-2 WT e ANXA1 KO in topo. Infine durante il terzo anno del Dottorato, ho avuto l'opportunità di lavorare presso “Institut national de la santé et de la recherche médicale” (INSERM), Marsiglia (FR), dove ho approfondito il ruolo di ANXA1 nel TME utilizzando modelli 3D tumorali, sia in monocoltura che in co-coltura con fibroblasti associati al cancro (CAF) e monociti. Presi insieme, i nostri dati suggeriscono in modo interessante l’importanza di ANXA1 come potenziale marcatore diagnostico/prognostico e/o terapeutico del CP. In questo modo, sarebbe possibile confermare la rilevanza di ANXA1 nella progressione del CP, come attore nel cross-talk tra le cellule tumorali e il microambiente. [a cura dell'Autore]