Identification of new genetic alterations and potential biomarkers in papillary thyroid carcinoma

Abstract

Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most frequent thyroid malignant neoplasia. Oncogene activation occurs in more than 70% of the cases. BRAF mutations occur in about 40% of PTCs, whereas RET rearrangements (RET/PTC oncogenes) are present in about 20% of cases. Finally, RAS mutations and TRK and PPARG rearrangements account for about 5% each of these malignancies. However, despite the presence of tumor-initiating driver events, cancer results from the progressive accumulation of mutations in genes that confer growth advantage over surrounding cells. A better understanding of molecular alterations of PTC will provide important insights into cancer etiology. It will also lead to advance in their diagnosis, possibly opening the way for developing novel molecular therapies. Thus, the aim of this PhD project is to deeply explore the transcriptome of PTC in order to identify new driver events in this type of cancer. In the first part of this study, we used RNA-Sequencing in a discovery cohort of 18 patients with papillary thyroid carcinoma to identify fusion transcripts and expressed mutations in cancer driver genes. Furthermore, we used targeted sequencing on the DNA of these same patients to validate identified mutations. We extended the screening to thyroids of 50 PTC patients and of 30 healthy individuals. Using this approach we identified new somatic mutations in CBL, NOTCH1, PIK3R4 and SMARCA4 genes. We also found mutations in DICER, MET and VHL genes, previously found mutated in other tumors, but not described yet in PTC. We also identified a new chimeric transcript generated by the fusion of lysine deficient protein kinase 1 (WNK1) and beta-1,4-N-acetylgalactosaminyl transferase 3 (B4GALNT3) genes and correlated with an overexpression of B4GALNT3 gene. Moreover, although protein coding genes play a leading role in cancer genetics, in recent years, many studies focused on a novel class of non coding RNAs, long non coding RNAs (lncRNAs), which regulate the expression levels of protein coding genes. Since deregulated expression of lncRNAs has been reported in many cancers, it suggests that that they may act as potential oncogene or tumorsuppressor. Thus, to assess if lncRNAs can exert a tumorigenic role in thyroid, in the second part of my PhD project I systematically quantified lncRNAs’ expression in PTC vs healthy thyroids using our RNA-Seq data. Combining ab initio reconstruction to a custom computational pipeline we found that novel and known lncRNAs are significantly altered in PTC, and some of them are possibly associated with cancer driver genes. Then we extensively focused on an unannotated lncRNA transcribed antisense to MET oncogene, named in this study MET-AS. Both genes are significantly up-regulated in a sub-class of PTCs - i.e. patients with BRAF gene mutations and RET gene rearrangements, compared to other PTCs and "non-tumor" thyroid biopsies. Preliminary data indicate that MET-AS knockdown induces down-regulation of MET, and induces a changes in cell cycle in a PTC cell line, suggesting the novel lncRNA might be a new MET regulator. Further studies should be conducted to demonstrate detailed mechanism of our findings. Finally, our data confirmed the genetic heterogeneity of papillary thyroid carcinoma revealing that gene expression correlates more with the mutation pattern than with tumor staging. Overall, this study provides new information about PTC genetic alterations, suggesting potential pharmacological adjuvant therapies in PTC. [edited by author]

Il carcinoma papillare tiroideo (PTC) costituisce circa l’80% di tutti i tumori maligni della tiroide. Ad oggi, sono state identificate mutazioni a carico del gene BRAF in circa il 40% di casi, mentre riarrangiamenti che coinvolgono il gene RET (RET/PTC) sono presenti in circa il 20% dei casi. Infine, mutazioni nei geni RAS e riarrangiamenti dei geni TRK e PPARG occorrono in circa il 5% dei casi ciascuno. Tuttavia, nonostante la presenza di alterazioni genetiche che possano dare inizio al processo canceroso, il tumore è il risultato del progressivo accumulo di mutazioni in geni che conferiscono un vantaggio di crescita sulle cellule circostanti. Pertanto, una conoscenza più approfondita delle alterazioni molecolari del carcinoma papillare tiroideo è fondamentale per migliorare gli aspetti diagnostici e prognostici, e la risposta individuale ai trattamenti farmacologici. Alla luce di ciò, il mio progetto di dottorato ha avuto come obiettivo principale l’analisi del trascrittoma del PTC al fine di individuare nuovi eventi molecolari che possano essere implicati in questo tipo di cancro. La prima parte di questo progetto è stata focalizzata sul sequenziamento - mediante RNA-Seq – di 22 RNA isolati da biopsie di tiroide (18 tiroidi affette da carcinoma papillare tiroideo, 4 tiroidi non tumorali) per identificare trascritti di fusione e mutazioni somatiche in geni espressi. I risultati sono stati validati sul DNA dei medesimi pazienti mediante sequenziamento diretto di Sanger. Inoltre, l’analisi mutazionale è stata estesa ad ulteriori 50 pazienti affetti da carcinoma papillare tiroideo e 30 individui sani. Mediante quest’approccio sono state identificate nuove mutazioni puntiformi nei geni CBL, NOTCH1, PIK3R4 e SMARCA4. Inoltre, l’analisi ha rivelato la presenza di mutazioni somatiche nei geni DICER1, MET e VHL, già note nella patogenesi in altri tipi di cancro, ma ad oggi non note nel PTC. Inoltre, è stato individuato un nuovo evento di fusione intra-cromosomico generato dalla fusione tra il primo esone del gene WNK1 (lysine deficient protein kinase 1) e il secondo esone del gene B4GALNT3 (beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 3). I geni codificanti rivestono un ruolo di primo piano nella genetica del cancro, ma negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su una nuova classe di RNA non codificanti, i long non coding RNA (lncRNAs), che regolano l’espressione dei geni codificanti. I livelli di espressione dei lncRNA sono spesso alterati in diversi tipi di tumori, suggerendo che essi possano agire sia da oncogeni sia da oncosoppressori. Al fine di valutare il loro potenziale ruolo nella tumorigenesi del PTC, la seconda parte di questo progetto è stata focalizzata sull’analisi computazionale dei lncRNA, sia nuovi che annotati, nei nostri dataset di RNASeq. Attraverso l’utilizzo di approcci per la ricostruzione ab initio del trascrittoma e di una pipeline computazionale sono stati indentificati i lncRNA significativamente deregolati nei campioni tumorali. Inoltre, per individuare i lncRNA che potessero regolare l’espressione genica in cis, alcuni di essi sono stati associati - per vicinanza al TSS (transcription start site) - a geni driver in diversi tipi di cancro. Infine, mi sono focalizzata su un lncRNA non annotato nei database pubblici, associato all’oncogene MET, ma trascritto dal filamento opposto. Si tratta pertanto di un lncRNA antisenso al gene MET, chiamato in questo lavoro di tesi MET-AS. Entrambi i geni sono significativamente sovraespressi in una sotto-classe di PTC - vale a dire i pazienti con mutazioni del gene BRAF e riarrangiamenti dell’oncogene RET – chiamati BRAF-like-, rispetto ai campioni tumorali PTC, con profilo trascrizionale simile ai campioni mutati nei geni RAS – chiamati RAS-like - e campioni di tiroide "non-tumorali". Esperimenti preliminari condotti in vitro su una linea cellulare di carcinoma papillare tiroideo, TPC-1, indicano che il silenziamento del lncRNA MET-AS induce una down-regolazione dell’oncogene MET, e induce un blocco del ciclo cellulare in fase G1, suggerendo che il lncRNA potrebbe essere un nuovo regolatore dell’oncogene MET. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi confermano l'eterogeneità genetica del carcinoma papillare della tiroide rivelando che l'espressione genica correla più con il profilo mutazionale dei pazienti che con la stadiazione del tumore. Inoltre, questo studio fornisce nuove informazioni sulle alterazioni genetiche del PTC, suggerendo potenziali terapie adiuvanti farmacologiche per questo tipo di cancro. [a cura dell'autore]